目前，治療癌癥在很大程度上依賴靶向藥物，但是只有極少數(shù)的藥物通過(guò)臨床試驗(yàn)。當(dāng)前臨床前模型的低預(yù)測(cè)能力仍然是要克服的巨大挑戰(zhàn)。體外技術(shù)動(dòng)物模型、微流體等已經(jīng)成為用于快速產(chǎn)生多個(gè)預(yù)測(cè)人體模型的重要工具。鑒于腫瘤微環(huán)境（TME）可以在癌癥進(jìn)展、藥物吸收和/或耐藥中發(fā)揮作用，因此微環(huán)境中的腫瘤已成為研究重點(diǎn)。尤其是在藥物反應(yīng)的情況下了解腫瘤是如何影響微血管重塑和功能的。缺乏有關(guān)TME中腫瘤與內(nèi)皮相互作用的知識(shí)導(dǎo)致無(wú)法預(yù)測(cè)現(xiàn)有人類(lèi)腫瘤模型。隨著用于生成體外微血管的工具（包括犧牲性模具和微流控技術(shù)）的開(kāi)發(fā)，研究脈管系統(tǒng)在腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用也逐漸增加，包括在芯片上檢查腫瘤細(xì)胞的定位和遷移。盡管許多模型已被開(kāi)發(fā)，但沒(méi)有一個(gè)模型能夠?qū)в醒芟到y(tǒng)的腫瘤整合到藥物中來(lái)?？紤]到許多治療化合物靶向腫瘤增殖和生存能力，有必要研究其對(duì)TME的作用。
近日，麻省理工學(xué)院的Mark R. Gillrie教授團(tuán)隊(duì)在《Advanced Functional Materials》上發(fā)表了Endothelial Regulation of Drug Transport in a 3D Vascularized Tumor Model，作者將3D腫瘤球體嵌入可灌注微血管網(wǎng)絡(luò)內(nèi)，文章旨在開(kāi)發(fā)一種能夠在生理腫瘤微環(huán)境中預(yù)測(cè)藥物遞送的系統(tǒng)。這是首次在血管系統(tǒng)中培養(yǎng)腫瘤球狀體，目的是探索更具生化的腫瘤微環(huán)境中的藥物傳遞，并研究其對(duì)內(nèi)皮的影響和作用。兩種具有代表性的腫瘤(卵巢癌和肺癌)在局部顯著影響血管。腫瘤鄰近血管的形態(tài)和通透性的改變導(dǎo)致了藥物傳遞的差異，在復(fù)雜的TME和較簡(jiǎn)單的球狀體之間很明顯，表明需要使用更相關(guān)的TME進(jìn)行藥物測(cè)試。在臨床上采用藥物外排泵抑制劑的情況下，還對(duì)藥物的遞送進(jìn)行了檢查，以改善化療藥物的吸收，證明其受內(nèi)皮調(diào)節(jié)。這種培養(yǎng)方法有助于研究各種靶向和生理學(xué)化合物，以及檢查免疫相互作用和原發(fā)性或獲得性耐藥性，這些都需要存在3D血管化微環(huán)境。
【研究成果】
1.血管化腫瘤模型的建立
為了增強(qiáng)癌癥藥物篩選的預(yù)測(cè)能力，作者開(kāi)發(fā)了體外血管化腫瘤模型作為改進(jìn)的病理生理平臺(tái)。該模型利用兩種3D體外技術(shù)作為簡(jiǎn)化的腫瘤模型，并使用基于水凝膠的微流控技術(shù)生成相關(guān)的血管化腫瘤微環(huán)境（TME）。在設(shè)備中嵌入腫瘤球體（TSs），可在可灌注微血管的情況下探測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)/死亡（圖 1）。該系統(tǒng)可以直接檢查T(mén)S對(duì)內(nèi)皮的影響，并且可以通過(guò)血管將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤。作者使用卵巢癌（Skov3）和肺腺癌（A549）細(xì)胞來(lái)檢驗(yàn)該平臺(tái)的實(shí)用性。兩種癌細(xì)胞都產(chǎn)生致密的聚集TS（圖1B）。然后在纖維蛋白凝膠中與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）和正常人肺成纖維細(xì)胞（nhLF）共同培養(yǎng)。在前72小時(shí)內(nèi)，單個(gè)細(xì)胞在TS存在下延伸，互連并形成血管網(wǎng)絡(luò)，然后在第5天形成管腔。在共培養(yǎng)期間測(cè)量TS的生長(zhǎng)，直徑增加（圖 1C，D）。
2．腫瘤特異性對(duì)血管形成的影響
除腫瘤表征外，這種培養(yǎng)方法還可用于研究周?chē)}管系統(tǒng)腫瘤的變化。培養(yǎng)7天后，兩種類(lèi)型的TS附近的脈管系統(tǒng)局部區(qū)域出現(xiàn)明顯差異（圖 2）。比起更遠(yuǎn)端的radial骨區(qū)域，與TS最鄰近（近端）的區(qū)域的血管密度（血管/總面積）均降低（圖2A，B）。然而，與A549相比，Skov3腫瘤導(dǎo)致血管密度顯著降低。Skov3在靠近TS的血管網(wǎng)絡(luò)中誘導(dǎo)局部凋亡區(qū)域，這與A549附近均勻分布相反（圖2C）。作者認(rèn)為血管密度和細(xì)胞凋亡的差異是由于兩種腫瘤類(lèi)型之間遷移模式或細(xì)胞因子表達(dá)的改變所致。第7天后，盡管大量的Skov3從TS表面遷移，但它們距TS的距離遠(yuǎn)小于A549（圖2D）。這種遷徙反應(yīng)可導(dǎo)致在TS附近血管死亡/密度差異，但也可能改變局部促炎性標(biāo)志物濃度、代謝物和生長(zhǎng)因子，或含有RNA或蛋白質(zhì)的外來(lái)體。因此，作者使用人類(lèi)細(xì)胞因子抗體陣列來(lái)研究這些差異（圖2E）。結(jié)果表明A549 TS導(dǎo)致血管生成因子（包括血管生成素）的更高表達(dá)。
3.腫瘤引起的血管通透性變化
癌細(xì)胞可誘導(dǎo)血管通透性增加很大程度上是VEGF等信號(hào)分子引起的。作者以3D腫瘤附近和遠(yuǎn)離空間的高分辨率研究這種現(xiàn)象。為此，將TS與新生的血管網(wǎng)絡(luò)共培養(yǎng)直至第4天，此時(shí)將單層接種到培養(yǎng)基通道中，最后在第7天使用熒光葡聚糖（40 kDa）將微血管灌注。通過(guò)熒光示蹤劑從血管內(nèi)到血管外空間的泄漏來(lái)計(jì)算微血管通透性 （圖3）。與A549相比，Skov3對(duì)與TS相鄰且距離更遠(yuǎn)的血管滲透性有更顯著的影響，這可能是因?yàn)槟[瘤相關(guān)信號(hào)的改變。此外，血管網(wǎng)絡(luò)（TS‐MVN）培養(yǎng)物中TNFα濃度僅略有增加，促炎細(xì)胞因子或其他局部分泌因子可能導(dǎo)致屏障功能受損，但需要進(jìn)一步研究。腫瘤對(duì)相鄰血管重塑和通透性的局部影響將改變腫瘤藥物遞送。
4. 3D化學(xué)療法的血管運(yùn)輸
為了測(cè)試該系統(tǒng)中藥物的遞送效率，用紫杉醇對(duì)微血管和球體進(jìn)行了處理。MVNs的滲透性僅在紫杉醇濃度增加的情況下處理1小時(shí)就顯著增加（圖4B）。作者比較了簡(jiǎn)單球體模型和系統(tǒng)之間的藥物輸送。紫杉醇被用于單獨(dú)治療和在血管網(wǎng)絡(luò)（TS‐MVN）內(nèi)的TS（圖4C–G）。在紫杉醇治療后72小時(shí)，腫瘤明顯的細(xì)胞死亡（圖4D）。對(duì)于單獨(dú)的球體（TS）治療，兩種腫瘤細(xì)胞系中紫杉醇濃度的增加都會(huì)導(dǎo)致胱天蛋白酶信號(hào)明顯升高（圖4E）。Caspase 3/7強(qiáng)度隨著紫杉醇治療而增加（圖4F）。雖然Skov3和A549 TS的半胱天冬酶強(qiáng)度沒(méi)有差異，但與TS相鄰的腫瘤外區(qū)域的細(xì)胞凋亡增加（圖4G）。作者還在紫杉醇治療后的24、48和72小時(shí)內(nèi)測(cè)量了腫瘤大?。ㄖ睆剑▓D4H），治療后A549 TSs的總直徑持續(xù)增加，而Skov3 TS的直徑縮小。
5.相關(guān)TME中的耐藥性
通過(guò)Western blot和流式細(xì)胞術(shù)在所有細(xì)胞類(lèi)型中檢測(cè)P-gp（也稱(chēng)為MDR1）的表達(dá)。在紫杉醇處理后，A549和Skov3中的平均P-gp表達(dá)降低，但HUVEC中的平均P-gp表達(dá)顯著提高（圖5A）。與A549和Skov3相比，488-Taxol的吸收更高（圖5C）。腫瘤細(xì)胞中P-gp表達(dá)降低可能與其他藥物外排蛋白的表達(dá)增加相對(duì)應(yīng)，從而有助于耐藥性。最后，在3D模型中檢查了P-gp函數(shù)（圖5E）,該結(jié)果表明，與不存在MVN相比，紫杉醇和P-gp抑制劑的運(yùn)輸都受到了MVN的阻礙。因此，P-gp抑制劑最終對(duì)所測(cè)試濃度的腫瘤中的化療藥物（488-Taxol）積累幾乎沒(méi)有影響，進(jìn)一步證明了采用3D血管化腫瘤模型相關(guān)病理學(xué)的重要性。
6. TME和擴(kuò)散限制的藥物遞送
在TS‐MVN系統(tǒng)中，成纖維細(xì)胞與腫瘤球體密切相關(guān)（圖 6A）。細(xì)胞占據(jù)了原本可以擴(kuò)散的體積，并且還可能沉積大量的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。實(shí)際上，諸如膠原蛋白III之類(lèi)的基質(zhì)蛋白表達(dá)增加與耐藥性相關(guān)，并在腫瘤附近強(qiáng)烈表達(dá)（圖6B）。對(duì)于兩種癌細(xì)胞類(lèi)型在不存在結(jié)合情況下分子擴(kuò)散性，緊鄰TS且在TS自身內(nèi)的直接TME基質(zhì)中的擴(kuò)散率顯著降低（圖6C）。雖然兩種細(xì)胞類(lèi)型在基質(zhì)或TME基質(zhì)中的擴(kuò)散率沒(méi)有差異，但腫瘤本身卻存在顯著差異。與Skov3相比，A549限制TS中的分子擴(kuò)散（圖6D）。
【結(jié)論】
該工作的人類(lèi)腫瘤芯片模型將可灌注微血管直接與腫瘤整合在一起，從而可以檢查關(guān)鍵的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。該模型證明了完整有效的血管網(wǎng)絡(luò)對(duì)于有效藥物輸送的重要性，因?yàn)槟[瘤引起的重塑會(huì)顯著影響局部TME和脈管系統(tǒng)。該模型有可能進(jìn)一步發(fā)展成更準(zhǔn)確的臨床前模型，以檢查復(fù)雜的免疫細(xì)胞和靶向抗體之間的相互作用以及化學(xué)療法。
